透骨消痛胶囊对凋亡软骨细胞Rac1和Cdc42表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.42.005

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (42): 6747-6751.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.42.005

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透骨消痛胶囊对凋亡软骨细胞Rac1和Cdc42表达的影响

叶锦霞^1，2，吴广文^1，2，李西海^1，2，郑春松^1，2，许惠凤^1，2，叶蕻芝^1，2，刘献祥^1，2

1福建中医药大学，福建省福州市 350122
2福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建省福州市 350122

修回日期:2014-08-28 出版日期:2014-10-08 发布日期:2014-10-08
通讯作者: 刘献祥，男，教授，博士生导师，福建中医药大学，福建省福州市 350122
作者简介:叶锦霞，女，1981年生，福建省漳州市人，汉族，福建中医药大学在读博士，助理研究员，主要从事中西医结合防治骨伤病研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目：基于内质网应激探讨透骨消痛胶囊干预骨性关节炎软骨退变的机制(81202836)

Effects of Tougu Xiaotong Capsules on the expression of Rac1 and Cdc42 in chondrocytes

Ye Jin-xia^{1, 2}, Wu Guang-wen^{1, 2}, Li Xi-hai^{1, 2}, Zheng Chun-song^{1, 2}, Xu Hui-feng^{1, 2}, Ye Hong-zhi^{1, 2}, Liu Xian-xiang^{1, 2}

1Academy of Integrated Medicine, Fujian University of TCM, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
2Fujian Provincial Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics, Fuzhou 350122, Fujian Province, China

Revised:2014-08-28 Online:2014-10-08 Published:2014-10-08
Contact: Liu Xian-xiang, Professor, Doctoral supervisor, Academy of Integrated Medicine, Fujian University of TCM, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; Fujian Provincial Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
About author:Ye Jin-xia, Studying for doctorate, Assistant researcher, Academy of Integrated Medicine, Fujian University of TCM, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; Fujian Provincial Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81202836

摘要/Abstract

摘要：

背景：透骨消痛胶囊治疗早、中期骨性关节炎有较好疗效，但作用机制尚未完全阐明。小GTP酶Rho能够抑制软骨细胞肥大分化，促进软骨细胞的凋亡。
目的：观察透骨消痛胶囊对体外培养凋亡大鼠关节软骨细胞Rac1和Cdc42的影响，并初步探讨其防治骨性关节炎的作用机制。
方法：采用4周龄SD大鼠膝关节软骨建立稳定的软骨细胞体外培养体系，采用甲苯胺蓝染色法对第3代软骨细胞进行鉴定。用20 μg/L的肿瘤坏死因子α诱导体外培养软骨细胞的凋亡，诱导成功后，给予透骨消痛胶囊(500，100，20 mg/L)孵育24 h后，分别用MTT法检测各组软骨细胞的存活率，用流式细胞仪检测各组软骨细胞的线粒体膜电位情况，Western Blot检测各组软骨细胞Rac1，Cdc42，Bcl-2及Bax蛋白表达。
结果与结论：透骨消痛胶囊能够减少肿瘤坏死因子α所致的软骨细胞凋亡，提高线粒体膜电位，提高细胞的存活率，同时能够下调Rac1，Cdc42，Bax蛋白的表达，上调Bcl-2蛋白表达，差异均有显著性意义(P < 0.05)。提示透骨消痛胶囊可能通过下调Rac1，Cdc42和 Bax蛋白表达，增加凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表达，从而抑制软骨细胞的凋亡，而起到治疗骨性关节炎的疗效。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 软骨细胞, 透骨消痛胶囊, 中药, 凋亡, Rac1蛋白, Cdc42蛋白, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Tougu Xiaotong Capsule has pretty good clinical therapeutic effect on osteoarthritis of early and middle periods. However, the mechanism of Tougu Xiaotong Capsule is not fully clarified. The RhoA GTPases can regulate chondrocyte apoptosis and hypertrophy.
OBJECTIVE: To observe the Tougu Xiaotong Capsule on the expression of Rac1and Cdc42 in tumor necrosis factor-α-induced in vitro cultured rat articular chondrocytes, and to explore its mechanism of action for combating osteoarthritis.
METHODS: Knee cartilage of the 4-week-old Sprague-Dawley rats was used to stably establish in vitro culture system of chondrocytes. Passage 3 chondrocytes were identified by toluidine blue staining. Chondrocyte apoptosis was successfully induced by 20 μg/L tumor necrosis factor-α and then Tougu Xiaotong Capsule at different dosage (500, 100, 20 mg/L) was given after 24-hour incubation. MTT assay was used to detect cell survival, flow cytrometry to measure mitochondrial membrane potential, and western blot assay to determine the protein expression of Rac1, Cdc42, Bax and Bcl-2.
RESULTS AND CONCLUSION: Tougu Xiaotong Capsule could reduce tumor necrosis factor-α-induced apoptosis of chondrocytes to improve the survival rate of the cells, and at the same time, could down-regulate the protein expression of Rac1, Cdc42 and Bax and increase the protein expression of Bcl-2 significantly (P < 0.05). Tougu Xiaotong Capsule possibly plays a therapeutic efficacy on osteoarthritis by reducing promote apoptosis Rac1, Cdc42 and Bax expression and increasing apoptosis inhibiting gene Bcl-2 expression, thereby to inhibit apoptosis of chondrocytes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: chondrocytes, apoptosis, drugs, Chinese HERBAL, rac1 GTP-binding protein, cdc42 GTP-binding protein

中图分类号:

R318

叶锦霞，吴广文，李西海，郑春松，许惠凤，叶蕻芝，刘献祥. 透骨消痛胶囊对凋亡软骨细胞Rac1和Cdc42表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(42): 6747-6751.

Ye Jin-xia, Wu Guang-wen, Li Xi-hai, Zheng Chun-song, Xu Hui-feng, Ye Hong-zhi, Liu Xian-xiang. Effects of Tougu Xiaotong Capsules on the expression of Rac1 and Cdc42 in chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(42): 6747-6751.

图/表（结果） 3

2.1 软骨细胞的形态结构及鉴定 倒置显微镜下，静置 24 h后，大多数软骨细胞开始贴壁，伸展并形成伪足样突起。早期软骨细胞一般呈多角形，胞核为圆形或椭圆形，位于胞体中心，核仁为1-3个。培养第4天，可见软骨细胞出现成簇生长，以梭形或椭圆形为主，培养第8天左右，软骨细胞增殖逐渐融合成单层，成不规则“铺路石”样，第3代软骨细胞边界清晰、分布均匀、形态结构一致，见图1A。第3代软骨细胞甲苯胺蓝染色，软骨细胞内可见蓝紫色异染颗粒，细胞周围可见异染颗粒，见图1B。

2.2 MTT法检测透骨消痛胶囊对软骨细胞肿瘤坏死因子α诱导损伤的影响 20 μg/L肿瘤坏死因子α对软骨细胞具有一定的损伤作用，与空白组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，而透骨消痛胶囊各给药组对损伤软骨细胞的保护作用随着药物质量浓度的加大而增大，细胞存活率明显增高，与模型组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，保护作用呈一定的量效关系。结果见表1。

2.3 透骨消痛胶囊对软骨细胞线粒体膜电位的影响 20 μg/L肿瘤坏死因子α作用于软骨细胞后，与空白组比较，线粒体膜通透性明显增加，线粒体膜电位显著下降(P < 0.01)，而透骨消痛胶囊100，500 mg/L两组均能有效地抑制肿瘤坏死因子α所致的线粒体膜电位下降，与模型组比较，差异有显著性意义(P < 0.01)。见图2，表1。

2.4 Western Blot检测各组软骨细胞Rac1，Cdc42，Bax和Bcl-2蛋白的表达 20 μg/L肿瘤坏死因子α干预4 h诱导软骨细胞凋亡后，能上调Rac1，Cdc42和Bax蛋白的表达，下调抑凋亡基因Bcl-2蛋白表达。而透骨消痛胶囊各组干预后，软骨细胞Rac1蛋白表达，透骨消痛胶囊各组明显低于肿瘤坏死因子α组(P < 0.01)；Cdc42蛋白表达，透骨消痛胶囊500，100和20 mg/L组明显低于肿瘤坏死因子α组(P < 0.01，P < 0.01，P < 0.05)；Bax蛋白表达，透骨消痛胶囊500 mg/L组、100 mg/L组明显低于肿瘤坏死因子α组(P < 0.01，P < 0.05)；Bcl-2蛋白表达，透骨消痛胶囊500 mg/L组、100 mg/L组明显低于肿瘤坏死因子α组(P < 0.01，P < 0.05)；结果表明，透骨消痛胶囊能不同程度地对抗肿瘤坏死因子α的损伤作用，下调Rac1，Cdc42和Bax蛋白的表达，上调Bcl-2蛋白表达，对细胞起到一定的保护作用。见图3。

参考文献

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引言

骨性关节炎又称退行性关节炎或增生性关节炎，是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病，主要表现为反复发作的关节疼痛、晨僵、关节肿胀及活动障碍，严重者可导致膝关节畸形，以中老年患者居多。骨性关节炎是多种因素共同作用下导致软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨三者降解和合成正常偶联失衡的结果，是一种常见慢性进展性关节疾病^[1]，其发病机制至今尚未完全明了，但已证明，关节软骨的退变是骨性关节炎的最直接原因。随着中国进入老龄化社会，骨性关节炎发病率有增加的趋势，如何防治关节软骨的退变是目前治疗的重点。

近年来的研究发现Rho蛋白是Ras超家族中小分子G蛋白的成员之一，小G蛋白可能是细胞信号转导的关键环节，在细胞的信号转导通路中作为信号转换器或分子开关，激活其下游靶分子Rho激酶而产生多种生物效应，如肌动蛋白细胞骨架形成维持细胞微观形态功能的稳定、细胞黏附与迁移、基因转录，增殖凋亡等。Rac1和Cdc42又是Rho家族蛋白重要成员，研究指出Rac1和Cdc42能够抑制软骨细胞肥大分化，促进软骨细胞的凋亡^[2]。因此，如何有效下调Rac1，Cdc42，Bax和Bcl-2蛋白表达，抑制软骨细胞凋亡可能是防治骨性关节炎的关键途径之一。

前期临床和实验研究发现，透骨消痛胶囊对膝骨性关节炎关节软骨具有很好的保护作用，可延缓关节软骨的退变^[3-6]。本次实验通过观察透骨消痛胶囊对体外培养大鼠关节软骨细胞凋亡率及Rac1，Cdc42，Bax和Bcl-2蛋白表达的影响，探讨其抑制软骨细胞凋亡的作用机制，为防治骨性关节炎提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：细胞学对比观察实验。

时间及地点：于2012年12月至2013年12月在福建中医药大学中西医结合研究院完成。

材料：

实验动物：清洁级4周龄雄性SD大鼠40只，体质量90-100 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005。

实验药物：透骨消痛胶囊是福建中医药大学附属第二人民医院的院内制剂(批准文号：闽制字Z20100006)，由巴戟天、杭白芍、川芎和肿节风组成。

实验方法：

软骨细胞体外培养体系的建立及鉴定：SD大鼠2只脱颈处死后，用体积分数75%的乙醇浸泡5 min，无菌条件下游离并用骨剪截取膝关节，置入无菌平皿，带入超净工作台操作：先用PBS充分漂洗，刮出关节周围附着的组织如肌肉、脂肪、骨膜、滑膜，PBS充分漂洗。用刀片削取每个关节表面的软骨，不要误带软骨下骨和骨膜，一般以不渗血为度。PBS充分漂洗软骨小块3次。用手术刀片切碎至1 mm×1 mm×1 mm大小，置入含5 mL 0.2%Ⅱ型胶原酶的玻璃瓶中，置于37 ℃水浴摇床消化，每2 h吸取一次上清液，120目尼龙网筛过滤，所得滤液1 000 r/min离心5 min，弃上清，收集细胞沉淀，重复3次。用DMEM完全培养液重悬细胞，吹打混匀后接种至培养瓶中培养。37 ℃体积分数5%CO₂培养箱原代培养，48 h后在倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，以后每2 d更换培养液，直到长成细胞单层，选第3代软骨细胞，0.25%胰蛋白酶消化备用。采用甲苯胺蓝染色法对第3代软骨细胞进行鉴定。

透骨消痛胶囊对肿瘤坏死因子α诱导损伤的软骨细胞凋亡的影响

MTT法检测软骨细胞的存活率：第3代软骨细胞以1×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于96孔板，每孔0.1 mL，72 h后将细胞分为3组：①空白对照组：孔中加入含血清培养基100 μL。②模型对照组：孔中加入剂量为20 μg/L的肿瘤坏死因子α的含血清培养基100 μL。③透骨消痛胶囊组：孔中加入剂量为20 μg/L的肿瘤坏死因子α的含血清培养基100 μL作用4 h后，换为不同质量浓度的透骨消痛胶囊100 μL(500，100，20 mg/L，DMEM完全培养基配制)。作用24 h后，将细胞上清液弃去，每孔加入MTT溶液 (0.5 g/L，无血清DMEM培养基配制，过滤)100 μL，37 ℃，孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入100 μL二甲基亚砜，振荡10 min，在570 nm波长的酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值^[7]。

流式细胞仪检测软骨细胞线粒体膜电位：第3代软骨细胞以1×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于6孔板，每孔2 mL，72 h后如上分组，药物干预24 h后，收集细胞，用PBS洗涤2遍，加入500 µL JC-1工作液将细胞混匀，37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中孵育15-20 min，收集细胞，用孵育缓冲液(1×)洗涤2遍，重悬，用流式细胞仪检测(Ex=488/ 530 nm)。绿色荧光通过通道FL1检测，红色荧光通过通道FL2检测。

Western Blot检测软骨细胞Rac1，Cdc42，Bax和Bcl-2蛋白的表达：第3代软骨细胞以1×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于6孔板，每孔2 mL，72 h后如上分组，药物干预结束后，用细胞裂解液抽提。含有等量蛋白的细胞裂解液用样品缓冲液溶解后，将细胞的蛋白样品定量，变性；进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；转膜；脱脂牛奶封闭2 h；洗膜，加入Bcl-2和Bax(稀释倍数1∶1 000)的一抗以及β-actin(稀释倍数1∶1 000)作为阳性对照，在4 ℃振荡过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释倍数1∶25 000)后，室温孵育1 h，然后用含0.25% tween-20的TBS洗膜，加入1∶1的ECL发光液，在25 ℃温育5 min，立即曝光，等条带清晰后将胶片取出，用凝胶成像系统扫描并进行数据分析。

主要观察指标：软骨细胞存活率、线粒体膜电位、Rac1，Cdc42，Bax和Bcl-2蛋白表达。

统计学分析：应用SPSS 16.0统计软件，数据以x(_)±s表示，多组间比较使用单因素方差分析，统计学显著性设定P < 0.05。

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讨论

软骨细胞凋亡是一种由基因调控的软骨细胞自主有序的死亡，是为了更好地适应生存坏境而主动争取的一种死亡过程，是调控软骨细胞功能状态的重要机制之一。各种刺激因素引起的凋亡信号，通过信号转导通路传至软骨细胞内的作用靶点，激活靶分子而产生酶级联效应，诱导软骨细胞的凋亡^[8-9]。目前研究表明，多种细胞因子和炎症介质活化(如转化生长因子β、白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α)均能激活Rho/Rock信号转导通路。白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α可调控关节软骨新陈代谢，刺激软骨细胞和滑膜细胞产生前列腺素E2、基质金属蛋白酶3，从而促进软骨基质的降解，加重软骨退变^[10-12]。其中肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子α被认为在骨性关节炎发病和进展中起到了关键作用^[13-14]。肿瘤坏死因子α可降低关节软骨细胞DNA的产生，并可促进基质金属蛋白酶的产生和分泌，引起软骨基质的降解，抑制软骨细胞合成具有透明软骨特性的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原及促进生成有纤维母细胞特性的Ⅰ型胶原，使软骨细胞变性、死亡，从而调控关节软骨新陈代谢，刺激软骨细胞和滑膜细胞产生前列腺素E2，促进软骨退变，最终引导软骨自动降解并最终发展成骨性关节炎^[15-19]。本实验发现，20 μg/L肿瘤坏死因子α作用于软骨细胞4 h，即可使软骨细胞发生凋亡。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，?Ψm )的理想荧光探针。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。通过荧光颜色的转变可以很方便地检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，也可作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

Rho家族成员是参与细胞内信号转导的重要蛋白，参与调节软骨细胞的增殖、基因表达及细胞骨架重组，其功能改变影响细胞生物学功能。其中Rac1是细胞信号传导通路的关键调节因子，是信号转导通路中的信号转换器或分子开关。细胞分裂周期蛋白42(Cdc42蛋白)是Rho家族蛋白重要成员之一，其功能主要涉及到调节细胞骨架中肌动蛋白重排，启动细胞内外信号，调控蛋白激酶，从而导致生长发育和多种细胞过程中的基因转录激活，来影响细胞生长、分化、侵袭和转移、细胞周期进展及转录的调节、细胞的分泌凋亡等一系列重要的生物现象^[20]。

软骨细胞凋亡受相关原癌基因调控，主要有Bcl-2基因家族，分2个亚型即促进细胞凋亡基因(Bax、Bad等)和抑制细胞凋亡基因(Bcl-2、Nr-13等)。研究发现Bcl-2和Bax共同调节结果可能是骨性关节炎患者软骨细胞凋亡增加^[21]，本实验结果显示，透骨消痛胶囊能够下调肿瘤坏死因子α诱导下的软骨细胞Rac1，Cdc42和Bax蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达，调节Bcl-2/Bax蛋白比例，降低软骨细胞的凋亡率，对细胞起到一定的保护作用。

综上所述，肿瘤坏死因子α能够诱导软骨细胞凋亡，模拟了关节软骨细胞的退变过程。透骨消痛胶囊可能是通过调节Rac1，Cdc42，Bax和Bcl-2蛋白的表达，降低软骨细胞的凋亡率，从而保护软骨细胞，减缓骨性关节炎的发生和发展。

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Effects of Tougu Xiaotong Capsules on the expression of Rac1 and Cdc42 in chondrocytes

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